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1.靶点简介
蛋氨酸腺苷转移酶(MATs)存在于所有代谢活性生物体中，其功能是形成S-腺苷-L-蛋氨酸(ADOMet)。ADOMet是初级代谢和调节大分子甲基化的通用甲基供体，MAT酶在一个独特的反应中由ATP和蛋氨酸合成ADOMet，其中蛋氨酸的硫攻击ATP的5‘-碳，导致ADOMet和三磷酸的形成。酶结合的三磷酸盐在产物释放前的第二步被水解成焦磷酸盐和正磷酸盐[1-4]。如下图1所示。
图1.甲硫氨酸腺苷转移酶催化的反应。MAT2A将ATP和蛋氨酸转化为ADOMet、焦磷酸盐和正磷酸盐
人类MAT的三种亚型包括在肝组织中表达的MAT1和MAT3，而MAT2A在人类细胞类型中普遍表达，是人类肿瘤中的主要形式[5]。晶体结构和机制研究表明，尽管它们在氨基酸序列上有85%的一致性，但它们的作用机制存在显著差异[6-7]。MAT2A以其纯化的活性形式形成功能同源二聚体，并与调节蛋白MAT2B结合。MAT2B通过增加MAT2A对ADOMet产物抑制的敏感性来调节MAT2A的活性，但不提供显著的速率增强[8-9]。细胞定位研究表明，MAT2A在胞浆和细胞核中都存在[10]。据报道，MAT2A的核浓缩发生在复制和随后的G2期，满足了DNA和组蛋白甲基化过程在S期细胞核内的高度甲基化要求[11]。ADOMet在转甲基化反应中的活性已被确认为肺癌干细胞发展的限速因子，使MAT2A和蛋氨酸循环的相关酶成为抗癌药物的靶点[12]。由MAT2A生产ADOMet的蛋氨酸来自膳食来源或多胺循环，在多胺循环中，由S-甲基-5‘-硫代腺苷磷酸化酶产生的5-甲硫基-D-核糖1-磷酸被循环为蛋氨酸[13-15]。据报道，MAT2A蛋白在结肠癌、肝癌、胃癌、血液和肝脏等癌症中表达增加[16-20]。大约15%的人类癌症显示MTAP（S-甲基-5‘-硫代腺苷磷酸化酶）基因缺失，因此缺乏多胺合成的蛋氨酸回收途径[21]。MTAP在chr9p21中的缺失通常包括CDKN2a抑癌基因位点的缺失。MATP/癌细胞的综合遗传致死性研究表明，这些癌细胞对MAT2A、PRMT5和PRMT1的抑制增加了敏感性[21-23]。这一发现导致了寻找针对这些酶的有效药物的研究[24]，2种药物已经进入临床试验，如下表所示。
表1.MAT2A临床在研抑制剂
2.AG-发现过程
ZenonKonteatis等[25]详细描述了AG-的药物发现工作，AG-是第一个口服生物利用的MAT2A抑制剂。这类MAT2A抑制剂是变构的，底物非竞争性的，通过阻止产物释放来抑制MAT2A的活性。还报告了临床前研究的结果，描述了这类抑制剂的体外和体内特征，重点是临床分子AG-。具体内容如下：
2.1.通过片段筛选鉴定MAT2A抑制剂
通过片段筛选和HitExpansion相似性搜索发现化合物1（IC50=μm）有微弱的酶抑制作用和确定了化合物2（IC50=1.5μm）被确定为最有效的MAT2A抑制剂，结构所下图2所示。化合物2的详细动力学分析显示了ATP和L-蛋氨酸的非竞争性抑制方式，表明其结合位置在催化活性位点之外。
图2.化合物1和化合物2结构
将化合物2与MAT2A蛋白在S-腺苷甲硫氨酸(MAT2A·SAM·2)配合物中共结晶，观察到两个拷贝的2结合在专有的MAT2A二聚体的界面上，每个MAT2A单体一个2分子，与先前报道的PF-的变构口袋相同(图3)。
图3.化合物2与MAT2A和反应产物SAM（PDB代码7KCE）的晶体结构。
备注：(A)MAT2A的同二聚体形式，两条蛋白链分别以绿色和青色显示。*色的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)分子处于活性位点，品红色的化合物2处于异位点。(B)MAT2A的变构结合位点。化合物2，在品红色，和水相互作用的残基Gly的红色球体。
化合物2与MAT2A形成关键的相互作用，包括从2的酰胺羰基和吡唑的氮到Arg的胍基的双齿氢键，以及2的两个苯基与蛋白质之间的两个疏水vanderWaals接触。在与MAT2A活性位点结合的SAM分子存在下测定的这种共晶结构表明，抑制剂结合通过关闭α螺旋门来捕获反应产物(图4左)。这些相互作用反映在酶活性的提高上，并确立了这个吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)类化合物是一个值得进一步研究的类别(图4右)。
图4.MAT2ASAM自由晶型的晶体结构(左)；结构类吡唑并[1，5-a]嘧啶-7(4H)-1和所有将在SAR活动中探索的取代基(右)。
2.2.基于结构的设计导致有效的、MTAP-Null选择性的MAT2A抑制剂AGI-
2的共晶结构表明，大部分疏水残基占据了2的R1和R2取代基周围的结合位点区域，这导致了R1和R2位的靶向取代基，从而建立了该系列的初始SARS。通过对R1和R2以及R3的改造得到了化合物AGI-。测定了MAT2A与SAM和AGI-的三元配合物(MAT2A·SAM·AGI-)的结构，并确认了变构结合位点和预测的R3处的苯酚取代水-的相互作用(图5左)。额外的相互作用是由支架C-3位的哌啶基团进行的，该支架被包裹在一个原型的残基Phe18、Phe20和邻接链MAT2A二聚体的Phe、Ser、Phe和Leu创造的疏水蛋白质环境中(图5左和图5右)。AGI-结构与酶数据见下图6。先导化合物AGI-在细胞检测中得到了充分的表征，并成为一个重要的体外工具，使进一步的细胞研究能够评估MAT2A生物学。
图5.近距离观察变构结合位点，突出显示AGI-及其与MAT2A蛋白和一个关键水分子的相互作用(左)；在S-腺苷甲硫氨酸存在下用AgI-测得的晶体结构（右）
图6.AGI-结构与酶数据
2.3.体内研究发现先导候选化合物AGI-
对AGI-药代动力学特性的初步评估表明，该药在大鼠体内的口服吸收较差，半衰期较短。同时，小鼠和人的体外代谢物鉴定研究表明，R1位的哌啶环是导致肝微粒体稳定性差的主要原因。着手提高代谢稳定性，首先试图在R3位生成包含其它氢键受体的类似物，以研究它们在提高代谢稳定性的同时维持酶活性的能力。进一步对R1和R3进行改造，最终发现只有在R1处引入苯基的AGI-具有良好的人微粒体稳定性（上图6）。
与体外数据一致的是，在33天荷瘤小鼠口服AGI-的研究中，复合治疗导致KP4MTAP缺失的异种移植瘤生长显著减少，对小鼠体重没有不良影响。在这项小鼠研究中建立了体内原理证明后，重点转向改善物理特性和细胞活性，以生产一种具有临床开发潜力的化合物。
2.4.临床候选化合物AG-的发现
AGI-具有非常高的PPB(超速离心法测得人血浆中99.9%以上)和CaCo-2测定的高外排率(6.0%)，预计到足够的人体暴露剂量是非常高的。进行结构改造，发现核心的六元环上N-甲基化降低了人的PPB，但降低了最大抑制率。用分子内氢键掩蔽核心NH可提高最大抑制率，但对其它ADME参数有影响。
通过内部氢键成功地掩蔽了极性，鼓励了R4的进一步修饰。然而，该区域额外的氢键供体的存在对渗透性提出了新的挑战，既掩盖了极性，又减少了需要同时追求的氢键供体的数量。经过一系列结构改造后得到化合物40，它保持了酶和细胞的效力，并在细胞增殖试验中显示出轻微的活性改善(图7)。
恶二唑酯41(图7)也表现出良好的酶活性和最大抑制率，证实了残基Ile的主链羰基上的第二个氢键对早期抑制剂的效力没有太大贡献。这一发现导致在R4位置含有70多个杂环的类似物亚系列。图7中报告了其中一些作为所获得结果的代表。3-氨基-异恶唑取代物(42)在酶分析中保持了良好的效价和占有率，但细胞活性较弱，对HCTMTAP阴性细胞增殖的抑制较差，但微粒体稳定性很好，PPB大大改善(图7)。在各种类似物中也观察到了类似的趋势，这里以2-吡啶(43)和2-哒嗪(44)为例，显示出良好的酶和细胞效力、出色的微粒体稳定性和良好的游离部分，但对HCTMTAP阴性细胞增殖的抑制作用较弱(图7)。R4位的吡啶比R4位的哒嗪具有更高的自由分数，这可能是由于R4位的吡啶与核心结构中的氢有较好的分子内氢键作用所致。药效和类药物性能综合最好的化合物是AG-，它将R4的2-吡啶和R1的环己烯结合在一起。测得AG-的pKa为8.56，比AGI-的pKa-6.3有较大幅度的提高。通过R4取代基2-吡啶的分子内相互作用掩蔽酸性氢(pKa=6.3)的影响是将互变异构稳定到最理想的互变异构，其中氢保持在R5的核心氮上。这在酶和细胞分析中都有良好的效力，同时使游离部分增加到1.54%(图7)。
图7.最终的R4改造产生具有平衡性质的化合物
MAT2A·SAM·AG-的共晶结构是在1.32A分辨率下测定的，并确认了设计模式(图8)。
图8.AG-的共晶结构。AG-(*色)的晶体结构证实了与MAT2A的结合模式、分子内氢键以及所有关键的相互作用
唯一的配体蛋白质相互作用的变化是化合物与Ile之间没有氢键，以及R4上的2-吡啶基与MAT2A蛋白残基之间新的疏水相互作用。这些改进使其在体外检测中具有良好的效价。在体外的HCTMTAP等基因细胞模型中，AG-显示出有效降低细胞内腺苷三磷酸腺苷水平，以及选择性抗增殖活性(图7)。进一步的生化研究证实，AG-与化合物2和AGI-保持相同的作用模式，对三磷酸腺苷和L-蛋氨酸都没有竞争性。AG-的性质表征总结如下图9。
图9.AG-性质表征
2.5.AG-动物模型研究
在胰腺KP4MTAP缺失的异种移植小鼠模型中，口服AG-mg/kg(qd)观察到持续38天的高水平血浆暴露与相应的肿瘤SAM水平降低。与体外数据一致，AG-治疗导致KP4MTAP缺失的异种移植瘤的肿瘤SAM水平和肿瘤生长呈剂量依赖性的降低(TGI=67%，mg/kg，p0.01)，并且耐受性良好，平均体重下降5%(图8D)(TGI=67%，mg/kg，p0.01)，且耐受性良好，平均体重损失5%。对皮下移植HCTMTAP-Null的小鼠也进行了一项类似的研究，AG-(mg/kgq.d.)治疗产生了显著的抑瘤作用(TGI=75%,p0.01)。在HCTMTAP-WT荷瘤小鼠中没有观察到等量剂量的AG-的抗增殖作用。小鼠和食蟹猴的安全性研究证实，AG-具有所需的临床前安全性，可以进行临床研究。目前正在进行一项I期临床试验，研究AG-在晚期实体瘤或伴有MTAP丢失的淋巴瘤中的作用。
总结：
先前研究癌细胞中MTAP丢失的工作表明，MTA的积累使细胞对短发夹状RNA介导的MAT2A和SAM利用酶PRMT5的耗竭敏感。然而，现有的PRMT5临床阶段抑制剂未能概括这种MTAP依赖的效应，可能是因为现有的抑制剂具有SAM非竞争性机制，该机制与MTA没有协同作用，因此不能选择性地抑制MTAP-null与MTAP-WT癌细胞的增殖。相反，通过抑制MAT2A降低SAM水平可以与MTA升高协同作用，选择性地抑制MTAP缺失细胞中的PRMT5，从而抑制细胞生长。因此，通过限制SAM的可用性，MAT2A的抑制允许选择性地抑制MTAP阴性的癌细胞和肿瘤中的PRMT5活性，并且通过限制在正常的MTAP-WT组织中抑制PRMT5的潜在*性，预计将提供比已知的PRMT5抑制剂更大的治疗窗口[25-28]。
由于目前MAT2A抑制剂开发仍处于很早期的临床开发阶段，另外一个抑制剂IDE-处于招募的更早期阶段，临床疗效需要通过进一步的患者疗效数据来证实。
参考文献：
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